分子雜交
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分子雜交（molecularhybridization）確定單鏈核酸堿基序列的技術(shù)。其基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸（叫做探針）間通過堿基配對形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術(shù)可在DNA與DNA，RNA與RNA，或DNA與RNA之間進(jìn)行，形成DNA-DNA，RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的雜交分子。作為探針的已知DNA或RNA片段一般為30～50核苷酸長，可用化學(xué)方法合成或者直接利用從特定細(xì)胞中提取的mRNA。探針必須預(yù)先標(biāo)記以便檢出雜交分子。標(biāo)記方法有多種，常用的為同位素標(biāo)記法和生物素標(biāo)記法。雜交方法又可分為液相雜交和固相雜交。
使單鏈DNA或 RNA分子與具有互補(bǔ)堿基的另一DNA或RNA 片斷結(jié)合成雙鏈的技術(shù)。即核酸分子間的雜交。相互雜交的兩種核酸分子間有時并非完全一致，但必有一定的相關(guān)性。早在1961年有人創(chuàng)建了DNA與RNA間的分子雜交，但至70年代才發(fā)展成基因分析中一種重要的分析技術(shù)，可鑒定基因的特異性。例如可將具有一定已知順序的某基因的 DNA片段，標(biāo)上放射性核素，構(gòu)成核酸探針，將它通過分子雜交與缺陷的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，從而把缺陷的基因顯示出來，借此可對許多遺傳性疾病進(jìn)行產(chǎn)前診斷?，F(xiàn)又用核酸分子雜交技術(shù)診斷乙型肝炎，以及研究其他病毒性疾病和癌瘤的基因結(jié)構(gòu)（癌基因）等。
核酸分子雜交的方法并不復(fù)雜。在雜交前先把待分析的DNA加熱或加堿使之變性,分開成單鏈；然后加入放射性核素標(biāo)記的核酸探針,降溫退火,即獲帶有放射性核素標(biāo)記的雙鏈雜交分子。1979年又發(fā)展成轉(zhuǎn)膜雜交，即將電泳分開的核酸片段，經(jīng)過轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行固相雜交反應(yīng)，用放射自顯影檢出之。此即著名的薩瑟恩氏印跡法。
無庸置疑，分子雜交的基礎(chǔ)是兩個核酸分子間的完全一致，或有一定的相似性或相關(guān)性。若所用的核酸探針的片段較長(幾百個核苷酸以上)，可以得到很準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。但若人工合成的寡核苷酸探針片段較短（如20～30個核苷酸），則難免會出現(xiàn)準(zhǔn)確性差的假陽性現(xiàn)象?，F(xiàn)又有非放射性核素標(biāo)記核酸探針，如以堿性磷酸酶標(biāo)記的酶標(biāo)核酸探針，以及以生物素標(biāo)記的核酸探針等，這必將有助于推動分子雜交在臨床醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用?！ ?/p>
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雜交技術(shù)
目前使用較多的是固相雜交法。此法是先將待測單鏈核酸樣品（如為雙鏈，則須先變性成為單鏈）結(jié)合到硝酸纖維素膜上，然后與溶液中的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。通過與電泳法和放射自顯影法結(jié)合，獲得雜交圖譜，再進(jìn)行定性或定量分析。分子雜交方法廣泛用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)中作為核酸片段堿基序列的檢測與鑒定手段。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中已用于某些病毒或細(xì)菌引起的感染性疾病的診斷。它也可用于基因工程。不同來源蛋白質(zhì)的亞基結(jié)合過程也可稱為雜交。
分子雜交（molecularhybridization）不同來源的核酸單鏈之間或蛋白質(zhì)亞基之間由于結(jié)構(gòu)互補(bǔ)而發(fā)生的非共價鍵的結(jié)合。根據(jù)這一原理發(fā)展起來的各種技術(shù)統(tǒng)稱為分子雜交技術(shù)，核酸分子雜交技術(shù)是分子遺傳學(xué)中的重要研究方法。
核酸分子雜交具有互補(bǔ)的堿基順序的單鏈核酸分子，可以通過堿基對之間非共價鍵（主要是氫鍵）的形成即能出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜種分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜種雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現(xiàn)。使單鏈聚合為雙鏈的過程稱為退火或復(fù)性。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。由于同位素被檢出的靈敏度高，所以在兩種核酸分子之間即使只有百萬分的同源順序也可以彼檢出。
核酸分子雜交按雜交中單鏈核酸所處的狀態(tài)可分為液相、固相和原位3類。前二類方法都要求預(yù)先從細(xì)胞中分離并純化雜交用的核酸。在液相分子雜交中，兩種來源的核酸分子都處于溶液中，可以自由運(yùn)動，其中有一種常是用同位素標(biāo)記的。從復(fù)性動力學(xué)數(shù)據(jù)的分析可探知真核生物基因組結(jié)構(gòu)的大致情況，如各類重復(fù)順序的含量及分布情況等。在固相分子雜交中，一種核酸分子被固定在不溶性的介質(zhì)上，另一種核酸分子則處在溶液中，兩種介質(zhì)中的核酸分子可以自由接觸。常用的介質(zhì)有硝酸纖維素濾膜、羥基磷灰石柱、瓊脂和聚丙烯酰胺凝膠等。早期用瓊脂作為固定介質(zhì)的分子雜交方法曾被用來測定從細(xì)菌到人多種生物的DNA的同源程度。
1975年由E．薩瑟恩首創(chuàng)的薩瑟恩吸印法是一種方便易行的固相雜交方法。先將待測的DNA用限制性內(nèi)切酶切成片段，然后通過凝膠電泳把大小不同的片段分開，再把這些DNA片段吸印到硝酸纖維膜上，并使吸附在濾膜上的DNA分子變性，然后和預(yù)先制備的DNA或RNA探針進(jìn)行分子雜交，最后通過放射自顯影就可以鑒別待測的哪個DNA片段和探針具有同源順序。精確控制雜交及洗滌條件（如溫度及鹽濃度），在同源順序中即使有一對堿基錯配也可檢出。這技術(shù)已應(yīng)用于遺傳病（基因?。┑?a href="/w/%E4%B8%B4%E5%BA%8A%E8%AF%8A%E6%96%AD" title="臨床診斷">臨床診斷。另一種相似的方法是將待測的RNA片段吸印在重氮芐氧甲基（DBM）纖維素膜或濾紙上，然后和預(yù)先制備的DNA探針進(jìn)行分子雜交，這種方法稱為諾森吸印法。這些技術(shù)大大地推進(jìn)了分子遺傳學(xué)研究和重組DNA技術(shù)的應(yīng)用。
原位（分子）雜交實際上是固相雜交的另一種形式，雜交中的一種DNA處在未經(jīng)抽提的染色體上，并在原來位置上被變性成單鏈，再和探針進(jìn)行分子雜交。在原位雜交中所使用的探針必須用比活性高的同位素標(biāo)記。雜交的結(jié)果可用放射自顯影來顯示，出現(xiàn)銀粒的地方就是與探針互補(bǔ)的順序所在的位置?！ ?/p>
基因定位
在基因定位的工作中，對固定在細(xì)胞學(xué)制片上的染色體DNA進(jìn)行原位雜交，可以將與探針互補(bǔ)的順序精確地定位到染色體的一定位置上。
在基因定位工作中，還可以應(yīng)用一種在電鏡下直接觀察雜種分子的原位雜交方法，即所謂的R-環(huán)法。R-環(huán)是在雙鏈DNA分子部分變性的情況下，單鏈的RNA分子和相應(yīng)的DNA序列中的一條互補(bǔ)的單鏈形成RNA-DNA的雜合雙鏈，同時DNA的另一條單鏈向外突出而形成的環(huán)狀圖象。由于每種mRNA由特定的基因所轉(zhuǎn)錄，和這一基因的一個DNA單鏈具有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，因此通過觀察標(biāo)記mRNA參與構(gòu)成的R環(huán)的位置就可以對產(chǎn)生這種mRNA的基因進(jìn)行定位，這一方法還可以用來研究斷裂基因的結(jié)構(gòu)。
在重組DNA技術(shù)中，有些專門的原位雜交方法可以用來篩選有探針順序的重組質(zhì)粒或噬菌體。此外，分子雜交方法還可以用來分離具有特定順序的核酸分子。例如使探針與細(xì)胞的總DNA進(jìn)行分子雜交，利用羥基磷灰石柱只吸附雙鏈分子的特性，可以分離與探針互補(bǔ)的DNA片段或RNA分子。
蛋白質(zhì)分子雜交來自不同的蛋白質(zhì)的亞基間也可以形成非共價鍵的結(jié)合，這是蛋白質(zhì)分子雜交的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)分子雜交技術(shù)可以用來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能以及相似的蛋白質(zhì)（如同工酶、血紅蛋白等）的親緣關(guān)系。例如通過人、狗、兔、驢、小鼠和蛙等動物的血紅蛋白的蛋白質(zhì)分子雜交測驗，根據(jù)能否形成雜種分子和雜種分子的量，可以判斷它們的蛋白質(zhì)分子的相似程度?！ ?/p>
實驗原理
分子雜交是通過配對堿基對之間的非共價鍵（主要是氫鍵）結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的雙鏈區(qū)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現(xiàn)。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交?！ ?/p>
雜交類型
隨著基因工程研究技術(shù)的迅猛發(fā)展，新的核酸分子雜交類型和方法在不斷涌現(xiàn)和完善。核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型：
（1）固相雜交
將參加反應(yīng)的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。由于固相雜交后，未雜交的游離片段可容易地漂洗除去，膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我復(fù)性等優(yōu)點，所以最為常用。常用的固相雜交類型有：菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、組織原位雜交和夾心雜交等。
（2）液相雜交
所參加反應(yīng)的兩條核酸鏈都游離在溶液中，一種研究最早且操作復(fù)合的雜交類型，在過去的30年里雖有時被應(yīng)用，但總不如固相雜交那樣普遍。主要缺點是雜交后過量的未雜交探針在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由于雜交檢測技術(shù)的不斷改進(jìn)，商業(yè)性基因探針診斷盒的實際應(yīng)用，推動了液相雜交技術(shù)的迅速發(fā)展。
固相膜核酸分子雜交
（1）菌落原位雜交（Colonyinsituhybridization）
將細(xì)菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA，再烘干固定DNA于膜上，與32P標(biāo)記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。
（2）斑點雜交（Dotblotting）
該方法是將被檢標(biāo)本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析，一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀（manifolds），如MinifoldI和II、Bio-Dot（Bio-Rad）和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀，反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時的膜就可以進(jìn)行雜交。
（3）Southern印跡雜交（Southernblotting）
是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值?；痉椒ㄊ菍NA標(biāo)本用限制性內(nèi)切酶消化后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離各酶解片段，然后經(jīng)堿變性，Tris緩沖液中和，高鹽下通過毛吸作用將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜（尼龍膜也較長用）上，烘干固定后即可用于雜交。凝膠中DNA片段的相對位置轉(zhuǎn)移到濾膜的過程中繼續(xù)保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標(biāo)記的探針雜交，利用放射自顯影術(shù)確定探針互補(bǔ)的每條DNA帶的位置，從而可以確定在眾多酶解產(chǎn)物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
（4）Northern印跡雜交（Northernblotting）
DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)。RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為westernblotting。Northern印跡雜交的RNA吸印與Southern印跡雜交的DNA吸印方法類似，只是在進(jìn)樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用NaOH，因為它會水解RNA的2’-羥基基團(tuán)。RNA變性后有利于在轉(zhuǎn)印過程中與硝酸纖維素膜結(jié)合，它同樣可在高鹽中進(jìn)行轉(zhuǎn)印，但在烘烤前與膜結(jié)合得并不牢固，所以在轉(zhuǎn)印后不能用低鹽緩沖液洗膜，否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB，因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結(jié)合，為測定片段大小，可在同一塊膠上加標(biāo)記物一同電泳，之后將標(biāo)記物膠切下，上色、照像。樣品膠則進(jìn)行Northern轉(zhuǎn)印，標(biāo)記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸銨中10min，在水中就可脫色。在紫外光下用一次成像相機(jī)拍照時，上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光，若接觸太多或白熾燈下暴露過久，會使RNA信號降低。從瓊脂糖凝膠中分離功能完整的mRNA時，甲基氫氧化汞是一種強(qiáng)力、可逆變性劑，但是有毒，因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應(yīng)避免RNase的污染。
（5）組織原位雜交（Tissueinsituhybridization）
簡稱原位雜交，指組織或細(xì)胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同，菌落原位雜交需裂解細(xì)菌釋出DNA，然后進(jìn)行雜交。而原位雜交是經(jīng)適當(dāng)處理后，使細(xì)胞通透性增加，讓探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的互補(bǔ)序列在胞內(nèi)的空間位置，這一點具有重要的生物學(xué)和病理學(xué)意義。例如，對致密染色體DNA的原位雜交可用于顯示特定的序列的位置；對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在染色質(zhì)內(nèi)的功能排布；與細(xì)胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細(xì)胞中和組織中的分布。此外，原位雜交還是顯示細(xì)胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術(shù)。
用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA，也可以是RNA探針，探針的長度通常以100～400nt為宜，過長則雜交效率減低。最近研究結(jié)果表明，寡核苷酸探針（16～30nt）能自由出入細(xì)菌和組織細(xì)胞壁，雜交效率明顯高于長探針。因此，寡核苷酸探針和不對稱PCR標(biāo)記的小DNA探針或體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記的RNA探針是組織原位雜交的優(yōu)選探針?！ ?/p>
試驗方法
雜交
通過堿基對之間非共價鍵的形成即出現(xiàn)穩(wěn)定的雙鏈區(qū)，這是核酸分子雜交的基礎(chǔ)。雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補(bǔ)，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補(bǔ)順序（即某種程度的同源性）就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進(jìn)行。由于DNA一般都以雙鏈形式存在，因此在進(jìn)行分子雜交時，應(yīng)先將雙鏈DNA分子解聚成為單鏈，這一過程稱為變性，一般通過加熱或提高pH值來實現(xiàn)。使單鏈聚合雙鏈的過程稱為退火或復(fù)性。用分子雜交進(jìn)行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用同位素或非同位素標(biāo)記成為探針，再與另一種核酸單鏈進(jìn)行分子雜交。核酸雜交技術(shù)基本上是Hall等1961年的工作開始的，探針與靶序列在溶液中雜交，通過平衡密度梯度離心分離雜交體。該法很慢、費(fèi)力且不精確，但它開拓了核酸雜交技術(shù)的研究。Bolton等1962年設(shè)計了第一種簡單的固相雜交方法，稱為DNA-瓊脂技術(shù)。變性DNA固定在瓊脂中，DNA不能復(fù)性，但能與其它互補(bǔ)核酸序列雜交。典型的反應(yīng)是用放射性標(biāo)記的短DAN或RNA分子與膠中DNA雜交過夜，然后將膠置于柱中進(jìn)行漂洗，去除游離探針，在高溫、低鹽條件下將結(jié)合的探針洗脫，洗脫液的放射性與結(jié)合的探針量呈正比。該法尤其適用于過量探針的飽和雜交實驗。60年代末，Britten等設(shè)計了另一種分析細(xì)胞基因組的方法。該法是研究液相中DNA的復(fù)性以比較不同來源核酸的復(fù)雜度，典型的方法是：從不同生物體（細(xì)菌、酵母、魚和哺乳動物等）內(nèi)分離DNA，用水壓器剪切成長約450核苷酸（nt）的片段。剪切的DNA液（含0.12mol/L磷酸鹽緩沖液或0.18mol/LNa+），經(jīng)煮沸使dsDNA熱變性成ssDNA。然后冷至約60℃，在此溫度孵育過程中，測定溶液一定時間內(nèi)的UV260nm的吸光度（減色效應(yīng)）來監(jiān)測互補(bǔ)鏈的復(fù)性程度。通常該實驗可比較不同來源生物DNA的復(fù)性速率，并可建立序列復(fù)雜度與動力學(xué)復(fù)雜度間的關(guān)系。
60年代中期Nygaard等的研究為應(yīng)用標(biāo)記DNA或RNA探針檢測固定在硝酸纖維素（NC）膜上的DNA序列奠定了基礎(chǔ)。如Brown等應(yīng)用這一技術(shù)評估了爪蟾rRNA基因的拷貝數(shù)。RNA在代謝過程中被3H尿嘧啶標(biāo)記，并在過量的情況下與膜上固定的基因組DNA雜交，繼而用RNase處理，消化非特異性結(jié)合的RNA。漂洗后計數(shù)以測定雜交探針的量。通過計算與已知量DNA雜交的RNA量即可評估rRNA基因數(shù)。由于當(dāng)時缺乏特異探針，這種方法不能用于研究其它特異基因的表達(dá)，這些早期過量探針膜雜交試驗實際上是現(xiàn)代膜雜交實驗的基礎(chǔ)。進(jìn)入70年代早期，許多重要的發(fā)展促進(jìn)了核酸雜交技術(shù)的進(jìn)展。例如，對特異基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的分析和對動力學(xué)雜交實驗又有興趣。固相化的PolyU–Sepharose和寡（dT）-纖維素使人們能從總RNA中分離PolyA+RNA。用mRNA的經(jīng)純化技術(shù)可從網(wǎng)織紅細(xì)胞總RNA中制備α-和β-珠蛋白mRNA混合物。這些珠蛋白mRNA首次被用于合成特異的探針以分析珠蛋白基因的表達(dá)。由于制備cDNA探針很繁瑣，所獲得cDNA的長度和純度也不穩(wěn)定。所以尋求新的探針來源是使分子雜交技術(shù)進(jìn)一步推廣的基礎(chǔ)。
70年代末期到80年代早期，分子生物學(xué)技術(shù)有了突破性進(jìn)展，限制性內(nèi)切酶的發(fā)展和應(yīng)用使分子克隆成為可能。各種載體系統(tǒng)的誕生，尤其是質(zhì)粒和噬菌體DAN載體的構(gòu)建，使特異性DNA探針的來源變得十分豐富。人們可以從基因組DNA文庫和cDNA文庫中獲得特定基因克隆，只需培養(yǎng)細(xì)菌，便可提取大量的探針DNA。迄今為止，已克隆和定性了許多特異DNA探針。
由于固相化學(xué)技術(shù)和核酸自動合成儀的誕生，現(xiàn)在可常規(guī)制備18～100個堿基的寡核苷酸探針。應(yīng)用限制酶和Southern印跡技術(shù)，用數(shù)微克DNA就可分析特異基因。特異DNA或RNA序列的量和大小均可用Southern印跡和Northern印跡來測定，與以前的技術(shù)相比，大大提高了雜交水平和可信度。
盡管取得了上述重大進(jìn)展，但分子雜交技術(shù)在臨床實用中仍存在不少問題，必須提高檢測單拷貝基因的敏感性，用非放射性物質(zhì)代替放射性同位素標(biāo)記探針以及簡化實驗操作和縮短雜交時間，這樣，就需要在以下三方面著手研究：第一，完善非放射性標(biāo)記探針；第二，靶序列和探針的擴(kuò)增以及信號的放大；第三，發(fā)展簡單的雜交方式，只有這樣，才能使DNA探針實驗做到簡便、快速、低廉和安全。
探針-靶反應(yīng)
從化學(xué)和生物學(xué)意義上理解，探針是一種分子，它帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物，并僅與特異靶分子反應(yīng)。抗原-抗體、外源凝集素-碳水化合物、親和素-生物素、受體-配基（ligand）以及互補(bǔ)核酸間的雜交均屬于探針-靶分子反應(yīng)。蛋白質(zhì)探針（如抗體）與特異靶分子是通過混合力（疏水、離子和氫鍵）的作用在少數(shù)特異位點上的結(jié)合，而核酸探針與互補(bǔ)鏈的反應(yīng)則是根據(jù)雜交體的長短不同，通過氫鍵在幾十、幾百甚至上千個位點上的結(jié)合。因為有機(jī)溶液可降低雜交體的穩(wěn)定性，所以，疏水反應(yīng)對互補(bǔ)核酸鏈的結(jié)合也有一定的作用，但對其特異性影響甚微。
核苷酸經(jīng)某一原子、功能基團(tuán)或長側(cè)鏈修飾后仍可能進(jìn)行堿基配對，這取決于修飾的部位和修飾的性質(zhì)。這一特性有助于理解非放射性核酸探針標(biāo)記物的設(shè)計和125I與DNA探針的化學(xué)結(jié)合。能與核酸結(jié)合的單一原子有銀、溴和碘等，這些元素可與嘧啶（胸腺嘧啶除外）環(huán)的C-5位或嘌呤環(huán)的C-8位反應(yīng)而不影響氫鍵的形成。溴亦可與胸腺嘧啶的C-6位結(jié)合。而胞嘧啶的C-4和腺嘌呤的N-6就不能被修飾，否則會影響堿基配對，盡管C的N-4位和A的N-6位參與了氫鍵形成，但它們也是標(biāo)記位點。這是因為標(biāo)記的探針每1kb只摻入10～30個修飾堿基，即僅4%～12%的單個堿基被修飾的類似物取代了。盡管摻入位點處的堿基配對較弱或不存在，但對整個雜交分子的穩(wěn)定性影響很小。防止氫鍵破壞的一種方法就是修飾探針，即探針克隆入M13載體中，只修飾載體區(qū)而不修飾插入片段。當(dāng)用放射性同位素32P和35S標(biāo)記核酸時，由于同位素是摻入核酸骨架的磷酸二脂鍵中，因此堿基未發(fā)生任何修飾。在5’端的磷酸基團(tuán)上可進(jìn)行化學(xué)修飾，這是標(biāo)記寡核苷酸探針的有效方法。因為這種方法是在一個探針分子上標(biāo)記一個檢測的基團(tuán)，所以，對長的克隆探針不適用。
此外，還可利用修飾的堿基來增加雜交的穩(wěn)定性和特異性。2-氫基腺嘌呤可替代寡核苷酸探針中的腺嘌呤通過形成3個氫鍵以增加雜交體的穩(wěn)定性。另外，在G-C豐富的RNA探針中，可用次黃嘌呤代替鳥嘌呤以獲得特異的雜交。因為次黃嘌呤和鳥嘌呤間只形成2個氫鍵，有效地降低了雜交體的Tm值，這樣，Tm值與雜交溫度更接近，雜交的嚴(yán)格性就增加了，因此，也就增加了特異性。
很顯然，結(jié)合位點的不同和可檢測基團(tuán)與檢測系統(tǒng)的不同，可派生出很多核酸探針標(biāo)記方法。這是由核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)所決定的。只有在對核酸分子的探針-靶反應(yīng)的化學(xué)本質(zhì)有了深入了解之后，才能更好地理解后面內(nèi)容?！ ?/p>
探針種類
分子雜交基因探針根據(jù)標(biāo)記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類，根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針，RNA探針，cDNA探針，cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類，DNA探針還有單鏈和雙鏈之分。下面分別介紹這幾種探針。
(一)DNA探針
DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細(xì)菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫的辦法，即將細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫。
然后用多種其它菌種的DNA作探針來篩選，產(chǎn)生雜交信號的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫為可表達(dá)性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽性克隆，所得到多個陽性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達(dá)文庫篩選得到的顯然只是特定基因探針。
對于基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質(zhì)的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質(zhì)，然后測定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然后根據(jù)這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫中篩選，陽性克隆即是目標(biāo)蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內(nèi)含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA探針用于檢測基因表達(dá)時雜交效率要明顯低于cDNA探針。DNA探針（包括cDNA探針）的主要優(yōu)點有下面三點：①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。
（二）cDNA探針
cDNA（complementaryDNA）是指互補(bǔ)于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA經(jīng)一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）的DNA聚合酶催化產(chǎn)生的，這種逆錄酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒時發(fā)現(xiàn)的。該酶以RNA為模板，根據(jù)堿基配對原則，按照RNA的核苷酸順序合成DNA（其中U與A配對）。這一途徑與一般遺傳信息流的方向相反，故稱反向轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄。攜帶逆轉(zhuǎn)錄酶的病毒侵入宿主細(xì)胞后，病毒RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下轉(zhuǎn)化成雙鏈cDNA，并進(jìn)而整合人宿主細(xì)胞染色體DNA分子，隨宿主細(xì)胞DNA復(fù)制同時復(fù)制。這種整合的病毒基因組稱為原病毒。在靜止?fàn)顟B(tài)下，可被復(fù)制多代，但不被表達(dá)，故無毒性。一旦因某種因素刺激而被活化，則該病毒大量復(fù)制，如其帶有癌基因，還可能誘發(fā)細(xì)胞癌變，后來發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶不僅普遍存在于RNA病毒中，而且哺乳動物的胚胎細(xì)胞和正在分裂的淋巴細(xì)胞也含有逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的作用是以dNTP為底物，RNA為模板，tRNA（主要是色氨酸tRNA）為引物，在Trna3’-OH末端上，5’－3’方向，合成與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，稱為互補(bǔ)DNA（cDNA），單鏈cDNA與模板RNA形成RNA-DNA雜交體。隨后在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性作用下，將RNA鏈水解成小片段。cDNA單鏈的3’末端回折形成一個小引物末端，逆轉(zhuǎn)錄酶又以第一條cDNA鏈為模板再合成第二第cDNA鏈，至此，完成逆轉(zhuǎn)錄全過程，合成雙鏈cDNA。
逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在已成為一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，廣泛用于基因的克隆和表達(dá)。從逆轉(zhuǎn)錄病毒中提取的逆轉(zhuǎn)錄酶已商品化，最常用的有AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸（oligo(dT)）用作引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成互補(bǔ)于mRNA的cRNA鏈，然后再用RNaseH將mRNA消化掉，再加入大腸桿菌的DNA聚合酶I催化合成另一條DNA鏈，即完成了從mRNA到雙鏈DNA的逆轉(zhuǎn)錄過程。所得到的雙鏈cDNA分子經(jīng)S1核酸酶切平兩端后接一個有限制酶切點的接頭（linker），再經(jīng)特定的限制酶消化產(chǎn)生粘性末端，即可與含互補(bǔ)末端的載體進(jìn)行連接。常用的克隆載體是λ噬菌體DNA，如λgt，EMBL和Charon系列等。用這類載體可以得到包含104以上的轉(zhuǎn)化子的文庫，再經(jīng)前面介紹的篩選方法篩選特定基因克隆。用這種技術(shù)獲得的DNA探針不含有內(nèi)含子序列。因此尤其適用于基因表達(dá)的檢測。
（三）RNA探針
RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析（nuclearrunontranscrip－tionassay）時，在體外將細(xì)胞核分離出來，然后在α-32P-ATP的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所合成mR－NA均摻入同位素而得到標(biāo)記，此混合mRNA與固定于硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進(jìn)行雜交，便可反映出該基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是一種反向探針實驗技術(shù)。
近幾年體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點兩側(cè)分別帶有SP6啟動子和T7啟動子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，如果在多克隆位點接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1h內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標(biāo)記物的利用率。
值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉(zhuǎn)錄RNA。這種可以得到同義RNA探針（與mRNA同序列）和反義RNA探針（與mRNA互補(bǔ)），反義RNA又稱cRNA，除可用于反義核酸研究外，還可用于檢測mRNA的表達(dá)水平。在這種情況下，因為探針和靶序列均為單鏈，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高幾個數(shù)量級。RNA探針除可用于檢測DNA和mRNA外，還有一個重要用途，在研究基因表達(dá)時，常常需要觀察該基因的轉(zhuǎn)錄狀況。在原核表達(dá)系統(tǒng)中外源基因不僅進(jìn)行正向轉(zhuǎn)錄，有時還存在反向轉(zhuǎn)錄（即生成反義RNA），這種現(xiàn)象往往是外源基因表達(dá)不高的重要原因。另外，在真核系統(tǒng)，某些基因也存在反向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生反義RNA，參與自身表達(dá)的調(diào)控。在這些情況下，要準(zhǔn)確測定正向和反向轉(zhuǎn)錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。
綜上所述，RNA探針和cRNA探針具有DNA探針?biāo)荒鼙葦M的高雜交效率，但RNA探針也存在易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜等缺點。
（四）寡核酸探針
前述三種探針均是可克隆的，一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進(jìn)行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應(yīng)用克隆。克隆探針一般較寡核苷酸探針特異性強(qiáng)，復(fù)雜度也高，從統(tǒng)計學(xué)角度而言，較長的序列隨機(jī)碰撞互補(bǔ)序列的機(jī)會較短序列少，克隆探針的另一優(yōu)點是，可獲得較強(qiáng)的雜交信號，因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標(biāo)記基因更多。但是，較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。對于僅是單個堿基或少數(shù)堿基不同的兩序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號相當(dāng)。這既是其優(yōu)點，又是其缺點。優(yōu)點是當(dāng)用于檢測病原微生物時，不會因病毒或細(xì)菌DNA的少許變異而漏診，缺點則是不能用于點突變的檢測。這種情況下，通常要采用化學(xué)合成的寡核苷酸探針。
合成的寡核苷酸探針具有一些獨特的優(yōu)點：①由于鏈短，其序列復(fù)雜度低，分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短，如20nt的寡核苷酸探針在濃度為100ng/ml，靶序列為1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L時，達(dá)到最大程度的雜交只需10min，而用2kb的克隆探針在同樣條件下達(dá)到完全雜交則需16h。②寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg），使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學(xué)或化學(xué)方法修飾以進(jìn)行非放射性標(biāo)記物的標(biāo)記。盡管克隆探針較特異，但通過細(xì)心篩選序列和/或選擇相對長的序列（＞30nt）亦可設(shè)計出非常特異的寡核苷酸探針。最常用的寡核苷酸探針有18～40個堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個堿基的探針。下面是篩選寡核苷酸針的一些原則。
①長18～50nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。②堿基成分：G+C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。③探針分子內(nèi)不應(yīng)存在互補(bǔ)區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。④避免單一堿基的重復(fù)出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。⑤一旦選定某一序更符合上述標(biāo)準(zhǔn)，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。
按上述原則選出的探針會增加成功的機(jī)會，選定后進(jìn)行合成與標(biāo)記，并摸索合適的雜交條件。方法是制備幾張點有特異靶DNA和不相關(guān)DNA的膜，各膜分別在不同溫度下與探針雜交，特異靶DNA雜交信號強(qiáng)而非特異DNA不產(chǎn)生任何雜交反應(yīng)的就是最適雜交溫度。在進(jìn)行點突變檢測雜交的反應(yīng)時，洗膜條件和溫度物選擇往往更為重要。所選漂洗條件必需使野生型靶DNA與探針產(chǎn)生強(qiáng)的雜交信號而突變型靶DNA則不產(chǎn)生雜交信號，這可以通過逐漸提高洗膜溫度來完成。
寡核苷酸探針還有一個重要用途。在用于檢測單個堿基差異時尚可采用一種稱為寡核苷酸限制（oligonucleotiderestriction）的技術(shù)。該技術(shù)只有在突變點位于某一限制性內(nèi)切酶識別位點時才有效。例如，鐮刀狀紅細(xì)胞貧血是因β珠蛋白基因的第6個寡碼子由GAG變成GTG，從而導(dǎo)致所編碼氨基酸由酪氨酸變成纈氨酸。突變的β-珠蛋白功能異常，稱作S珠蛋白，而野生型稱為A珠蛋白，其基因型分別為βS和βA。恰好突變點A→T位于DelI的識別序列CT－NAG之內(nèi)，這就為設(shè)計寡核苷酸限制實驗創(chuàng)造了條件。方法是合成一個長40個堿基的寡核苷酸探針，其5’末端距突變堿基有11個堿基，該探針與βA基因的非編碼鏈互補(bǔ)。將此探針的5’末端標(biāo)記上32P。雜交方法采用液相雜交法，即在液相中將靶DNA變性解鏈，然后與探針退火，產(chǎn)生雜交體。如靶DNA為βA型，則兩條鏈完全互補(bǔ)，并產(chǎn)生DdeI的酶切位點；如待檢DNA為βS型，則所形成的雜交體中兩條鏈在突變堿基處不配對，從而不能被DelI所識別。用DelI消化雜交DNA，顯然βA會被切開而βS不被切開。
βADNA雜交體被切開后，5’端探針序列因只有8個堿基，與雜交鏈結(jié)合不緊而解離，從而產(chǎn)生游離的5’端標(biāo)記8核苷酸單鏈。不被切開的βS雜交體尚可被另一個限制酶HinfI消化，該酶的識別位點緊靠DelI識別位點上游。βS雜交DNA經(jīng)HinfI消化后，將釋出探針DNA的5’末端3核苷酸小片段。βADNA雜交體因已無HinfI識別序列，故而不能被HinfI消化。這樣βA和βSDNA經(jīng)此寡核苷酸探針雜交和DelI及HinfI消化后，分別產(chǎn)生游離的8核苷酸（8nt）和3核苷酸（3nt）片段，它們可以經(jīng)電泳分離后進(jìn)行放射自顯影而獲證實。藉此策略，可輕易將各種β珠蛋白突變型鑒別開，如純合野生型AA結(jié)果為僅有8nt片段，純合突變型SS則僅可檢出3nt片段，而雜合子AS型則兩種片段均存在。
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