臨床生物化學(xué)/酶活性測(cè)定條件的選擇和限定
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引言中已強(qiáng)調(diào)了僅在一定條件下酶反應(yīng)速度v才和酶量成正比例。一定條件是什么？這些條件之間有無(wú)主次關(guān)系？如何選擇合適的測(cè)定條件？這些都是實(shí)驗(yàn)室工作者在設(shè)計(jì)或選擇測(cè)酶活性濃度方法時(shí)必須面對(duì)的問(wèn)題。
首先可從理論上探討在什么特定情況下的反應(yīng)速度才可能與酶量成正比例。酶的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程可簡(jiǎn)化如下：
式中Kp可看成為ES的解離常數(shù).Michaclis和Menten通過(guò)推導(dǎo)可得出下式方程式
此式中V為最大反應(yīng)速度，對(duì)一定濃度的酶而言為一常數(shù)。Km為實(shí)驗(yàn)室工作所熟系的米氏常數(shù)。上式也可改寫(xiě)為：
Kp和Km雖為常數(shù)，但［S］為變量，因此
在一般情況下不可能為常數(shù)，即v≠k［E］，從理論上很清楚說(shuō)明反應(yīng)速度v和酶量E之間在絕大多數(shù)條件下只存正比，即v∝［E］。而非正比例關(guān)系。但在底物［S］濃度很大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)Km的特殊條件下Km值由于相對(duì)很小可忽略不計(jì)。此式可變?yōu)椋?/p>
由于底物［S］濃度很大，使酶飽和。ES已達(dá)極限，反應(yīng)速度不再增加，故此時(shí)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)V。即從理論上說(shuō)只有測(cè)定的是酶最大反應(yīng)V。此時(shí)反應(yīng)速度才和酶量E成正比例。也只有在此基礎(chǔ)上建立起來(lái)的測(cè)定方法才是可靠的、準(zhǔn)確的。
Kp是酶學(xué)中很重要的一個(gè)常數(shù)，即周轉(zhuǎn)數(shù)（Turnover number），從上式可得出。
其含義為每分鐘每分子酶轉(zhuǎn)換底物分子數(shù)。酶的Kp數(shù)值約在50-105min-1之間。碳酸酐酶是目前已知最高酶變率的酶（36×10-6min-1）。Kp的倒數(shù)代表每一酶催化循環(huán)的時(shí)間，以碳酸酐酶為例
1/Kp=lmin/136×106＝0.028×10－6min＝1.7μs
即每隔1.7μs，一分子酶就和一個(gè)底物結(jié)合，反應(yīng)一次。
國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）和不少?lài)?guó)家包括我國(guó)的一些學(xué)會(huì)建立了或正在建立測(cè)定酶活性濃度的推薦或參考方法。都毫無(wú)例外地提出測(cè)酶活性濃度方法所選擇的測(cè)定條件應(yīng)是酶反應(yīng)的“最適條件”以保證酶具有最大的催化活性。實(shí)質(zhì)上就是基于以上理論考慮，要測(cè)定酶的最大反應(yīng)速度V。
我國(guó)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)文件中對(duì)最適條件是這樣提出：①選合適的底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類(lèi)和濃度。②指示酶和輔助酶的種類(lèi)和濃度。③反應(yīng)混合液的最適pH，緩沖液種類(lèi)和濃度。④其它影響酶活性的因素，如去除各種抑制劑。并提出：在某些情況下，為了獲得更好的測(cè)定重復(fù)性或更大的臨床價(jià)值，可考慮對(duì)上述“最適條件”作適度的修改。
 其它方法 | 底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類(lèi)和濃度  |
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