電子順磁共振
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電子順磁共振（electron paramagnanetic resonance，EPR）是由不配對(duì)電子的磁矩發(fā)源的一種磁共振技術(shù)，可用于從定性和定量方面檢測(cè)物質(zhì)原子或分子中所含的不配對(duì)電子，并探索其周?chē)h(huán)境的結(jié)構(gòu)特性。對(duì)自由基而言，軌道磁矩幾乎不起作用，總磁矩的絕大部分（99％以上）的貢獻(xiàn)來(lái)自電子自旋，所以電子順磁共振亦稱(chēng)“電子自旋共振”（ESR）。
目錄 |
研究歷史
電子順磁共振首先是由前蘇聯(lián)物理學(xué)家 E.K.扎沃伊斯基于1944年從MnCl2、CuCl2等順磁性鹽類(lèi)發(fā)現(xiàn)的。物理學(xué)家最初用這種技術(shù)研究某些復(fù)雜原子的電子結(jié)構(gòu)、晶體結(jié)構(gòu)、偶極矩及分子結(jié)構(gòu)等問(wèn)題。以后化學(xué)家根據(jù)電子順磁共振測(cè)量結(jié)果，闡明了復(fù)雜的有機(jī)化合物中的化學(xué)鍵和電子密度分布以及與反應(yīng)機(jī)理有關(guān)的許多問(wèn)題。美國(guó)的B.康芒納等人于1954年首次將電子順磁共振技術(shù)引入生物學(xué)的領(lǐng)域之中，他們?cè)谝恍┲参锱c動(dòng)物材料中觀察到有自由基存在。20世紀(jì)60年代以來(lái)，由于儀器不斷改進(jìn)和技術(shù)不斷創(chuàng)新，電子順磁共振技術(shù)至今已在物理學(xué)、半導(dǎo)體、有機(jī)化學(xué)、絡(luò)合物化學(xué)、輻射化學(xué)、化工、海洋化學(xué)、催化劑、生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、地質(zhì)探礦等許多領(lǐng)域內(nèi)得到廣泛的應(yīng)用?！ ?/p>
基本原理
電子是具有一定質(zhì)量和帶負(fù)電荷的一種基本粒子，它能進(jìn)行兩種運(yùn)動(dòng)；一種是在圍繞原子核的軌道上運(yùn)動(dòng)，另一種是對(duì)通過(guò)其中心的軸所作的自旋。由于電子的運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生力矩，在運(yùn)動(dòng)中產(chǎn)生電流和磁矩。在外加恒磁場(chǎng)H中，電子磁矩的作用如同細(xì)小的磁棒或磁針，由于電子的自旋量子數(shù)為1/2，故電子在外磁場(chǎng)中只有兩種取向：一與H平行，對(duì)應(yīng)于低能級(jí)，能量為-1/2gβH；一與H逆平行，對(duì)應(yīng)于高能級(jí)，能量為+1/2gβH，兩能級(jí)之間的能量差為gβH。若在垂直于H的方向，加上頻率為v的電磁波使恰能滿(mǎn)足hv=gβH這一條件時(shí)，低能級(jí)的電子即吸收電磁波能量而躍遷到高能級(jí)，此即所謂電子順磁共振。在上述產(chǎn)生電子順磁共振的基本條件中，h為普朗克常數(shù)，g為波譜分裂因子（簡(jiǎn)稱(chēng)g因子或g值），β為電子磁矩的自然單位，稱(chēng)玻爾磁子。以自由電子的g值=2.00232，β=9.2710×10-21爾格/高斯，h=6.62620×10-27爾格.秒，代入上式，可得電磁波頻率與共振磁場(chǎng)之間的關(guān)系式：（兆赫）=2.8025H（高斯）
主要檢測(cè)對(duì)象
可分為兩大類(lèi)：
①在分子軌道中出現(xiàn)不配對(duì)電子（或稱(chēng)單電子）的物質(zhì)。如自由基（含有一個(gè)單電子的分子）、雙基及多基（含有兩個(gè)及兩個(gè)以上單電子的分子）、三重態(tài)分子（在分子軌道中亦具有兩個(gè)單電子，但它們相距很近，彼此間有很強(qiáng)的磁的相互作用，與雙基不同）等。
②在原子軌道中出現(xiàn)單電子的物質(zhì)，如堿金屬的原子、過(guò)渡金屬離子（包括鐵族、鈀族、鉑族離子，它們依次具有未充滿(mǎn)的3d，4d，5d殼層）、稀土金屬離子（具有未充滿(mǎn)的4f殼層）等?！ ?/p>
電子順磁共振波譜儀
絕大多數(shù)儀器工作于微波區(qū)，通常采用固定微波頻率v，而改變磁場(chǎng)強(qiáng)度H來(lái)達(dá)到共振條件。但實(shí)際上v若太低，則所用波導(dǎo)答尺寸要加大，變得笨重，加工不便，成本貴；而v又不能太高，否則H必須相應(yīng)提高，這時(shí)電磁鐵中的導(dǎo)線(xiàn)匝數(shù)要加多，導(dǎo)線(xiàn)加粗，磁鐵要加大，亦使加工困難?！ ?/p>
常用微波頻率
電子順磁共振波譜儀常用的微波頻率有下列3種情況（見(jiàn)表）。
| 波帶 | 頻率v（千兆赫） | 波長(zhǎng)λ（厘米） | 相應(yīng)的共振磁場(chǎng)H（高斯） |
| X | 9.5 | 3.16 | 0.3390 |
| K | 24 | 1.25 | 0.8560 |
| Q | 35 | 0.86 | 1.2490 |
其中尤以X波帶最為常用?！ ?/p>
組成部分
電子順磁共振波譜儀由4個(gè)部件組成：①微波發(fā)生與傳導(dǎo)系統(tǒng)；②諧振腔系統(tǒng)；③電磁鐵系統(tǒng)；④調(diào)制和檢測(cè)系統(tǒng)?！ ?/p>
主要特性
由于通常采用高頻調(diào)場(chǎng)以提高儀器靈敏度，記錄儀上記出的不是微波吸收曲線(xiàn)（由吸收系數(shù)X對(duì)磁場(chǎng)強(qiáng)度H作圖）本身，而是它對(duì)H的一次微分曲線(xiàn)。后者的兩個(gè)極值對(duì)應(yīng)于吸收曲線(xiàn)上斜率最大的兩點(diǎn)，而它與基線(xiàn)的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)于吸收曲線(xiàn)的頂點(diǎn)。
g值從共振條件hv=gβH看來(lái)，h、β為常數(shù)，在微波頻率固定后，v亦為常數(shù)，余下的g與H二者成反比關(guān)系，因此g足以表明共振磁場(chǎng)的位置。g值在本質(zhì)上反映出一種物質(zhì)分子內(nèi)局部磁場(chǎng)的特征，這種局部磁場(chǎng)主要來(lái)自軌道磁矩。自旋運(yùn)動(dòng)與軌道運(yùn)動(dòng)的偶合作用越強(qiáng)，則g值對(duì)ge（自由電子的g值）的增值越大，因此g值能提供分子結(jié)構(gòu)的信息。對(duì)于只含C、H、N和O的自由基，g值非常接近ge，其增值只有千分幾。
當(dāng)單電子定域在硫原子時(shí)，g值為2.02-2.06。多數(shù)過(guò)渡金屬離子及其化合物的g值就遠(yuǎn)離ge，原因就是它們?cè)又熊壍来啪氐呢暙I(xiàn)很大。例如在一種Fe3+絡(luò)合物中，g值高達(dá)9.7。
線(xiàn)寬通常用一次微分曲線(xiàn)上兩極值之間的距離表示（以高斯為單位），稱(chēng)“峰對(duì)峰寬度”，記作ΔHpp。線(xiàn)寬可作為對(duì)電子自旋與其環(huán)境所起磁的相互作用的一種檢測(cè)，理論上的線(xiàn)寬應(yīng)為無(wú)限小，但實(shí)際上由于多種原因它被大大的增寬了。
超精細(xì)結(jié)構(gòu)如在單電子附近存在具有磁性的原子核，通過(guò)二者自旋磁矩的相互作用，使單一的共振吸收譜線(xiàn)分裂成許多較狹的譜線(xiàn)，它們被稱(chēng)為波譜的超精細(xì)結(jié)構(gòu)。設(shè)n為磁性核的個(gè)數(shù)，I為它的核自旋量子數(shù)，原來(lái)的單峰波譜便分裂成（2nI＋1）條譜線(xiàn)，相對(duì)強(qiáng)度服從于一定規(guī)律。在化學(xué)和生物學(xué)中最常見(jiàn)的磁性核為1H及14N，它們的I各為1/2及1。如有n個(gè)1H原子存在，即得（n＋1）條譜線(xiàn)，相對(duì)強(qiáng)度服從于（1＋x）n中的二項(xiàng)式分配系數(shù)。如有n個(gè)14N原子存在，即得（2n＋1）條譜線(xiàn)，相對(duì)強(qiáng)度服從于（1＋x＋X2）n中的3項(xiàng)式分配系數(shù)。超精細(xì)結(jié)構(gòu)對(duì)于自由基的鑒定具有重要價(jià)值。
吸收曲線(xiàn)下所包的面積可從一次微分曲線(xiàn)進(jìn)行兩次積分算出，與含已知數(shù)的單電子的標(biāo)準(zhǔn)樣品作比較，可測(cè)出試樣中單電子的含量，即自旋濃度?！ ?/p>
在生物學(xué)中的應(yīng)用
研究生物組織中的自由基
在凍干的動(dòng)物組織和植物組織內(nèi)均檢測(cè)出自由基，而在代謝過(guò)程活躍的組織（如綠葉、肝、腎）樣品內(nèi)，自由基含量很高。又在蟻、果蠅、活鼠鼠尾。腐黑物、植物樹(shù)脂和各種動(dòng)物與植物來(lái)源的黑素內(nèi)均測(cè)知有自由基存在。
研究酶促反應(yīng)中的自由基
直接證實(shí)了L.米夏埃利斯關(guān)于生物底物的氧化有階段性的假說(shuō)（見(jiàn)生物氧化），已知有半醌型自由基作為中間產(chǎn)物生成，自由基濃度隨著電子轉(zhuǎn)移速率或酶活性而增大。在某些情況下，可利用超精細(xì)結(jié)構(gòu)來(lái)鑒定自由基，并進(jìn)而提供關(guān)于酶催化機(jī)理的信息和探測(cè)有關(guān)酶的活性部位的結(jié)構(gòu)。
研究光合原初反應(yīng)
證明在葉綠體、活的水藻和能進(jìn)行光合作用的細(xì)菌中有光照所引起的自由基生成，它們?nèi)繀⑴c光合電子傳遞鏈。這有助于闡明太陽(yáng)能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能的本質(zhì)。
研究輻射原初過(guò)程
對(duì)于生物物質(zhì)受高能輻射作用后所產(chǎn)生的自由基作定性與定量的檢測(cè)，已提供了輻射損傷程度及損傷部位的信息。還從較深入的研究得出涉及輻射效應(yīng)的原初機(jī)理、氧效應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、自旋轉(zhuǎn)移、生物物質(zhì)的輻射敏感性、輻射防護(hù)和輻射敏化的許多極為重要的結(jié)果。
研究癌變過(guò)程中的自由基
已觀察到某些癌組織內(nèi)的自由基含量低于正常組織。在用多種致癌物喂大鼠后，肝內(nèi)可檢出一個(gè)特征信號(hào)，在癌的診斷中可能有重要價(jià)值。還證明了由致癌物在組織中形成自由基的現(xiàn)象?！ ?/p>
研究生物組織中的順磁金屬離子
包括過(guò)渡族金屬離子，對(duì)一些動(dòng)物組織、植物材料和微生物都能見(jiàn)到銅（Ⅱ）、錳（Ⅱ）或鐵的EPR信號(hào)。已用EPR技術(shù)證實(shí)了一些含順磁性金屬的酶的活性與這些金屬的原子價(jià)態(tài)直接有關(guān)，這些金屬離子可能參與底物與酶的結(jié)合，例如黃嘌呤氧化酶中的鉬、琥珀酸脫氨酶中的鐵、血漿銅藍(lán)蛋白中的銅。
對(duì)血紅蛋白、肌紅蛋白及其數(shù)種衍生物的單晶，用EPR法測(cè)出的血紅素平面對(duì)外界晶軸的取向，比用別的方法所得結(jié)果更準(zhǔn)確，且提供了有關(guān)分子中央鐵原子的化學(xué)鍵的信息，井證明血紅蛋白分子內(nèi)4個(gè)血紅素平面并不相互平行。
許多鐵硫蛋白的發(fā)現(xiàn)，多半是由于電子順磁共振測(cè)定結(jié)果，在其活性部位的鑒定和了解結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系方面，電子順磁共振亦作出了主要貢獻(xiàn)。
自旋標(biāo)記法
由美國(guó)的 H.M.麥康奈爾于1965年首創(chuàng)，系指將一種穩(wěn)定的自由基（最常用者為氮氧自由基）結(jié)合到單個(gè)分子或處于較復(fù)雜系統(tǒng)內(nèi)的分子上的特定部位，而從電子順磁共振波譜取得有關(guān)標(biāo)記物環(huán)境的信息。在進(jìn)行自旋標(biāo)記時(shí)，應(yīng)注意到盡量保持專(zhuān)一性和減少對(duì)天然系統(tǒng)的生物特性和分子特性引起的擾動(dòng)。
自旋標(biāo)記物有4個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)溶劑的極性敏感，因此得以探究標(biāo)記物周?chē)h(huán)境的疏水性或親水性；②對(duì)分子轉(zhuǎn)動(dòng)速率極為敏感，因此能計(jì)測(cè)標(biāo)記物的環(huán)境內(nèi)所容許的活動(dòng)程度，特別是計(jì)測(cè)由某種生化過(guò)程引起生物分子構(gòu)象的改變；③EPR波譜較簡(jiǎn)單，易于分析，由14N引起的三峰波譜能提供許多有價(jià)值的信息；④不存在來(lái)自抗磁性環(huán)境的干擾信號(hào)。
自旋標(biāo)記物可通過(guò)共價(jià)鍵或通過(guò)象酶與輔酶、酶與底物、抗體與半抗原，以及膜與甾體的相互作用中所包含的那些非共價(jià)的引力被連接到目的物。自旋標(biāo)記法現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于研究生物高分子的構(gòu)象、酶的活性部位的結(jié)構(gòu)、脂質(zhì)體和生物膜的結(jié)構(gòu)及應(yīng)用于免疫分析。
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