多肽合成儀
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一、基本概念 1.多肽 是一種與生物體內(nèi)各種細(xì)胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過(guò)肽鍵結(jié)合而成的化合物。 2.多肽合成 是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過(guò)去的多肽合成是在溶液中進(jìn)行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來(lái)，經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個(gè)常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。多肽合成總的來(lái)說(shuō)分成兩種：固相合成和液相多肽合成。 3.多肽合成儀 多肽合成是一個(gè)以樹(shù)脂（人工合成的固相介質(zhì)）為載體，在一定的反應(yīng)條件下重復(fù)添加氨基酸，經(jīng)過(guò)化學(xué)反應(yīng)后合成多肽的過(guò)程，多肽合成儀即是用來(lái)合成多肽的儀器。一般情況下，多肽合成儀整體由主體、傳輸設(shè)備、動(dòng)力裝置以及軟件系統(tǒng)組成。
二、歷史背景 1． 固相合成法的誕生 多肽合成研究已經(jīng)走過(guò)了一百多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開(kāi)始關(guān)注多肽合成，由于當(dāng)時(shí)在多肽合成方面的知識(shí)太少，進(jìn)展也相當(dāng)緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開(kāi)始使用芐氧羰基(Z)來(lái)保護(hù)α-氨基，多肽合成才開(kāi)始有了一定的發(fā)展。 到了20世紀(jì)50年代，有機(jī)化學(xué)家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產(chǎn)素，胰島素等，同時(shí)在多肽合成方法以及氨基酸保護(hù)基上面也取得了不少成績(jī)，這為后來(lái)的固相合成方法的出現(xiàn)提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。 1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，這個(gè)在多肽化學(xué)上具有里程碑意義的合成方法，一出現(xiàn)就由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)?lái)了多肽有機(jī)合成上的一次革命，并成為了一支獨(dú)立的學(xué)科——固相有機(jī)合成(SPOS)。因此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Merrifield經(jīng)過(guò)了反復(fù)的篩選，最終屏棄了芐氧羰基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基(BOC)用于保護(hù)α-氨基并在固相多肽合成上使用，同時(shí)，Merrifield在60年代末發(fā)明了第一臺(tái)多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個(gè)氨基酸)。 1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保護(hù)α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應(yīng)完全，而且由于其反應(yīng)條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎(chǔ)的各種肽自動(dòng)合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。同時(shí)，固相合成樹(shù)脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護(hù)基，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護(hù)上也取得了豐碩的成果。
2． 多肽合成儀的誕生 雖然Merrifield在發(fā)明固相多肽合成科學(xué)并取得巨大成功的同時(shí)，使用了自主研發(fā)的合成設(shè)備，但卻沒(méi)因此將多肽合成儀引入市場(chǎng)。1970年，Beckman公司開(kāi)發(fā)的全自動(dòng)多肽合成儀Beckman 990 Peptide Synthesizer 作為第一臺(tái)投入市場(chǎng)的科研用多肽合成儀，被美國(guó)多所大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室采用。 幾乎同一時(shí)間，Vega Biotechnologies, Inc.公司開(kāi)發(fā)出兩款經(jīng)濟(jì)型多肽合成儀：Vega’s Coupler 1000與Vega’s Coupler 250 (不久又推出Vega’s Coupler 296),其將多肽合成后續(xù)的在線切割理念結(jié)合到設(shè)備中，所有反應(yīng)器采用防爆玻璃材質(zhì)，防止TFA的腐蝕。被當(dāng)時(shí)的肽化學(xué)界稱為最經(jīng)濟(jì)適用的多肽合成儀。 而今，Beckman與Vega’s兩家公司均停止的多肽合成儀的研發(fā)與制造，而轉(zhuǎn)向到更多面的化學(xué)合成、分離、檢測(cè)技術(shù)設(shè)備的研制產(chǎn)業(yè)中。
3． 多肽合成儀的發(fā)展 a) 第一代多肽合成儀
第一代多肽合成儀是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer為代表的，誕生在上世紀(jì)七十年代。
雖然隨著生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和發(fā)展，如今第一代多肽合成儀已全部退出了市場(chǎng)。但1990年以前的眾多肽化學(xué)文獻(xiàn)都是在此實(shí)驗(yàn)設(shè)備上運(yùn)行研發(fā)而來(lái)，第一代的多肽合成儀為之后的合成儀研發(fā)與制造產(chǎn)生了重大意義。
b) 第二代多肽合成儀
第二代多肽合成儀是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90為代表的，誕生在上世紀(jì)八十年代。此兩款設(shè)備也是目前市場(chǎng)上仍在銷(xiāo)售的最早的多肽合成儀。 PS3 的設(shè)計(jì)原理是采用氮?dú)夤呐莸姆磻?yīng)方式來(lái)對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行攪拌，即合成儀上反應(yīng)器是固定的，氮?dú)鈴姆磻?yīng)器的下方通過(guò)反應(yīng)器到上部排出，在這一過(guò)程中產(chǎn)生的汽泡把固相和液相混合起來(lái)。這樣設(shè)計(jì)的好處是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低，但反應(yīng)相對(duì)溫和：1）有時(shí)候多肽-固相載體在靜電作用下會(huì)“抱團(tuán)”，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調(diào)高氮?dú)獾膲毫σ韵o電作用；而在靜電作用消除后要把壓力立刻調(diào)低，不然的話較高的壓力會(huì)把多肽-固相載體“吹”到反應(yīng)器液面上方。由于多肽-固相載體具有較強(qiáng)的粘壁性，一旦被粘到反應(yīng)器液面上方就再也無(wú)法下來(lái)，也就是無(wú)法再參加反應(yīng)。顯然第一代機(jī)器是無(wú)法自動(dòng)作這樣的壓力調(diào)整的，這就是造成反應(yīng)“死角”的重要原因。反應(yīng)死角會(huì)降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長(zhǎng)時(shí)間氮?dú)夤呐輹?huì)使溶液揮發(fā)，液面降低后一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無(wú)法再參加反應(yīng)。3）氮?dú)庀牧看?，運(yùn)行成本增大。 ACT90的設(shè)計(jì)原理是反應(yīng)器在直立下圍繞原點(diǎn)作左右擺動(dòng)，或者圓周運(yùn)動(dòng)。ACT的多肽合成儀同樣具有反應(yīng)溫和的特點(diǎn)，即轉(zhuǎn)動(dòng)角度與速度都不能夠完全達(dá)到氨基酸耦合的極限，反應(yīng)往往需要更長(zhǎng)的時(shí)間。
c) 第三代多肽合成儀
第三代多肽合成儀是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 與C S Bio公司的CS336為代表的無(wú)死角多肽合成儀為代表的，誕生在上世紀(jì)九十年代。 ABI433的設(shè)計(jì)原理是反應(yīng)器上方相對(duì)固定，而下方作圓周360度快速旋轉(zhuǎn)，帶動(dòng)反應(yīng)器里的固液兩相從底部向上作螺旋運(yùn)動(dòng)，一直達(dá)到反應(yīng)器的最上方。換句話說(shuō)，溶液可以達(dá)到反應(yīng)器內(nèi)部的任意點(diǎn)，真正做到了無(wú)死角。由于攪拌速率可達(dá)每分鐘1800轉(zhuǎn)的高速，反應(yīng)得以充分完全。由于無(wú)死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場(chǎng)后最后一款儀器）至今在世界上還占有著很大的比例。當(dāng)然，ABI產(chǎn)品的售價(jià)也是最高的。由于部件使用頻率高，電磁閥會(huì)經(jīng)常損壞，而ABI將7個(gè)電磁閥做成模塊化的設(shè)計(jì)，壞掉一個(gè)電磁閥必須要更換整個(gè)模塊，無(wú)形中增加了維修成本。 CS336的設(shè)計(jì)原理是反應(yīng)器中點(diǎn)為圓心，上下做180度旋轉(zhuǎn)攪拌，攪拌速度可達(dá)180rpm，同時(shí)其采用了氮?dú)夤呐莘磻?yīng)方式的優(yōu)越性，將氮?dú)獯祫?dòng)作為可選反應(yīng)方式融入反應(yīng)方法中，多肽合成儀在科研領(lǐng)域的高耦合率效果得到充分體現(xiàn)。
4． 多肽合成儀的現(xiàn)狀 進(jìn)入二十世紀(jì)以來(lái)，各大合成儀制造公司相繼推出了升級(jí)產(chǎn)品和新產(chǎn)品，如Protein Technologies公司推出Tribute雙通道多肽合成儀，將“短信通知”功能融入產(chǎn)品，增添了用戶與設(shè)備之間的緊密感，更加人性化；C S Bio公司對(duì)其從研發(fā)型到生產(chǎn)型設(shè)備的UV Online Monitor系統(tǒng)配置統(tǒng)一升級(jí)，用戶可直觀看到每一部氨基酸偶聯(lián)反應(yīng)的狀態(tài)并可根據(jù)數(shù)據(jù)調(diào)整出最佳合成效果與工藝；Advanced ChemTech公司自2005年破產(chǎn)重組后分裂為兩家新公司，其中Aapptec延續(xù)了其前身的生產(chǎn)步驟，推出Focus XC三通道合成儀。美國(guó)另一家公司CEM以蛋白質(zhì)有機(jī)反應(yīng)設(shè)備的制造著稱，推出了微波多肽合成儀同樣可以合成簡(jiǎn)單的小分子多肽。其采用微波加熱方式，大大提高了反應(yīng)速度，將反應(yīng)的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾倍?？上У氖窃诩訜岬那闆r下副反應(yīng)也相應(yīng)增多，多肽純度不能與之前的第三代甚至第二代產(chǎn)品媲美。另外，微波加熱方法無(wú)法放大，故不適合用作多肽藥物的研發(fā)。
三、功能研究 1． 運(yùn)行原理 多肽合成儀以固相合成為反應(yīng)原理，在密閉的防爆玻璃反應(yīng)器中使氨基酸按照已知順序（序列，一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端）不斷添加、反應(yīng)、合成，操作最終得到多肽載體。固相合成法，大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為了防止副反應(yīng)的發(fā)生，參加反應(yīng)的氨基酸的側(cè)鏈都是保護(hù)的。羧基端是游離的，并且在反應(yīng)之前必須活化。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成，但對(duì)于某些短肽，tBoc因其產(chǎn)率高的優(yōu)勢(shì)仍然被很多企業(yè)所采用。
具體合成由下列幾個(gè)循環(huán)組成：
1） 去保護(hù)：Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護(hù)基團(tuán)。 2） 激活和交聯(lián)：下一個(gè)氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?；罨膯误w與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。循環(huán)：這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。 3） 洗脫和脫保護(hù)：多肽從柱上洗脫下來(lái)，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑（TFA） 洗脫和脫保護(hù)。
2． 基本元件 a) 反應(yīng)器 Reaction Vessel 數(shù)百年來(lái)，制藥業(yè)的反應(yīng)器/反應(yīng)釜 設(shè)備以玻璃材質(zhì)最為常見(jiàn)，因其完全透明且耐腐蝕，而被眾多化學(xué)、生物學(xué)專家沿用。多肽合成的過(guò)程需要操作人員直觀監(jiān)測(cè)，同時(shí)合成后可進(jìn)行在線切割（切割試劑TFA的強(qiáng)腐蝕性對(duì)反應(yīng)器材質(zhì)有了極大限制），這些要求限制反應(yīng)器以玻璃材質(zhì)最為適用。 而玻璃材質(zhì)的反應(yīng)器在制造工藝上有極大的難度限制：①燒制工藝：磨口精度要求極高，正如很多國(guó)產(chǎn)設(shè)備都無(wú)法達(dá)到要求出現(xiàn)漏液漏氣現(xiàn)象，玻璃壁均勻程度等。②配合攪拌柄以及密封裝置的成套加工工藝③防爆處理 b) 氨基酸儲(chǔ)罐 Amino Acid Reservoirs c) 溶劑儲(chǔ)罐 Solvent Reservoirs d) 量筒 Metering Vessel e) 轉(zhuǎn)液瓶 Transfer Vessel f) 感應(yīng)器 Sensor 多端觸發(fā)器自感應(yīng)定量量取法，直觀、科學(xué)、相對(duì)誤差最低。 g) 廢液桶 Waste Carboy 廢液桶通常選擇容積較大的HDPE桶，保證通風(fēng)良好，同時(shí)需安裝感應(yīng)器裝置時(shí)刻檢測(cè)廢液情況，避免溢出。 3． 控制配件 a) 電磁閥 Valves 多肽合成儀中的電磁閥屬于敏感配件，其控制液路的串聯(lián)與閉路，在氨基酸轉(zhuǎn)移與量取，溶劑轉(zhuǎn)移與量取兩步驟中起到至關(guān)重要的作用。不同品牌的合成儀對(duì)電磁閥的設(shè)計(jì)與排布也略有不同。如PTI合成儀中，電磁閥成矩陣式排列，便于觀察，但若發(fā)生堵塞情況則又有維修的不便，一個(gè)電磁閥堵塞則可能造成整塊矩陣式電磁閥全部更換；CSBio合成儀中電磁閥采取Normally Close 方式，在非溶液轉(zhuǎn)移操作過(guò)程中，電磁閥閉合，減少了污染與堵塞的發(fā)生，整體呈管路式排布；ABI433合成儀的電磁閥為7位組合，萬(wàn)一出現(xiàn)堵塞情況則整組更換，查找檢修時(shí)非常方便，但成本也相對(duì)高了6倍。 b) 控制面板 Control Box 控制面板內(nèi)往往含有光敏組建，部分控制電磁閥以及感應(yīng)器控制組。與電腦主機(jī)的控制系統(tǒng)、合成儀統(tǒng)一的鏈接在一起，完成多肽合成的全過(guò)程。 c) 軟件系統(tǒng) Operating Software 多肽合成儀的操作軟件。不同品牌合成儀所注冊(cè)的軟件也不同。
4． 檢測(cè)方法 a) UV Monitor 在多肽合成儀中，在線檢測(cè)耦合效果的裝置，如UV Monitor往往是選配裝置，客戶可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要選購(gòu)。其功能是讓操作者直觀的看到多肽合成的每一部氨基酸偶聯(lián)效果，從而針對(duì)特定的序列做合成設(shè)置的調(diào)整，最終達(dá)到最佳合成效果。 對(duì)于不熟悉多肽合成儀操作的用戶來(lái)說(shuō)，UV Monitor是相當(dāng)重要的。
b) 試劑檢測(cè)：沒(méi)有選購(gòu)在線檢測(cè)附件的多肽合成儀用戶，也可以采用試劑檢測(cè)方法做基本的耦合效果測(cè)定實(shí)驗(yàn)。
固相多肽合成中，主要是通過(guò)檢測(cè)樹(shù)脂上游離氨基來(lái)判斷連接效率，檢測(cè)方法稱為Kaiser方法，其檢測(cè)結(jié)果，如果有游離氨基的時(shí)候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。 Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液 配制中的吡啶需要經(jīng)過(guò)茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測(cè)過(guò)程，取少量樹(shù)脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹(shù)脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說(shuō)明連接完全。 c) 其它檢測(cè)游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等。
四、專利文件 對(duì)于大學(xué)、實(shí)驗(yàn)室等科研用戶以及需要申報(bào)新藥的生產(chǎn)企業(yè)來(lái)講，使用的合成設(shè)備的國(guó)際專利號(hào)以及規(guī)定內(nèi)容是非常有用的信息。 ACT多肽合成儀專利：United States Patent 4746490 Activotec合成應(yīng)用技術(shù)專利： IPC8 Class: AC07K104FI USPC Class: 525 5411 CEM合成技術(shù)專利：US 7,582,728 C S Bio多肽合成儀專利：US Patent 5,380,495 & 5,453,487. C S Bio多肽合成儀反應(yīng)器專利：US Patent 6320025 PTI多肽合成儀設(shè)備專利： U.S. Patent No. 5,203,368 (Symphony). No. 5,064,940 (PS3). PTI多肽合成儀反應(yīng)器專利：U.S. Patent No. 5,980,839. Shimadzu多肽合成儀專利：United States Patent 5344613
五、選購(gòu)指南 1． 科研單位考慮因素 a) 設(shè)備本身對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的幫助 ①對(duì)于多肽合成化學(xué)反應(yīng)，使用設(shè)備可避免人手工操作對(duì)人體的傷害(試劑腐蝕) ②由于程序化設(shè)定，可保證每步驟偶合反應(yīng)的充分性以及實(shí)驗(yàn)整體的穩(wěn)定性 ③可以合成難肽以及超長(zhǎng)肽(可提供其使用研究型多肽合成儀合成多肽的檢測(cè)報(bào)告) ④在休息時(shí)間可以不間斷合成工作 研究型多肽合成儀需滿足循環(huán)式氨基酸添加位置多于20個(gè)，在夜間以及周末，預(yù)先配好的保護(hù)氨基酸可根據(jù)程序設(shè)置自動(dòng)偶聯(lián)并替換新的位置，保證了實(shí)驗(yàn)的效率，完全實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)！ ⑤即使實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了很多年，更換了很多研究人員，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還可以保存在電腦中。 b) 國(guó)際國(guó)內(nèi)相關(guān)研究人員使用該多肽合成儀進(jìn)行的有效研究結(jié)果 多肽合成儀的制造商應(yīng)提供其公開(kāi)發(fā)表的研究性論文多篇。 為進(jìn)行多肽合成實(shí)驗(yàn)的學(xué)生們提供研究數(shù)據(jù)并使其模擬合成過(guò)程，更好的體驗(yàn)機(jī)械操作多肽合成的全步驟，檢測(cè)自己的合成結(jié)果。 c) 多肽合成儀設(shè)備的專利保護(hù)對(duì)今后研究結(jié)果的影響 考慮到高等院校實(shí)驗(yàn)研究的嚴(yán)密性，結(jié)合對(duì)后期研發(fā)成果的保護(hù)機(jī)制，通常采購(gòu)的設(shè)備需要具有其國(guó)際專利許可，以確保實(shí)驗(yàn)研究項(xiàng)目的順利申報(bào)。 d) 制造商的生產(chǎn)規(guī)模 制造商的品牌、生產(chǎn)規(guī)模以及其所擁有的生產(chǎn)資格認(rèn)證，都從側(cè)面反映了其供應(yīng)設(shè)備的質(zhì)量、信譽(yù)以及對(duì)客戶的服務(wù)保證。
2． 生產(chǎn)企業(yè)考慮因素 參考科研單位選購(gòu)小型設(shè)備的考慮因素，對(duì)于生產(chǎn)型企業(yè)，使用不同品牌的多肽合成儀往往還應(yīng)考慮其連貫完整的設(shè)備生產(chǎn)線，從小型合成規(guī)模至生產(chǎn)型合成規(guī)模的各種設(shè)備齊全。通常大型設(shè)備可根據(jù)反應(yīng)器大小判斷其合成規(guī)模，通?？稍诰€切割的玻璃材質(zhì)反應(yīng)器/反應(yīng)釜需達(dá)100L，可保證批量產(chǎn)數(shù)十公斤的多肽產(chǎn)品。
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